jueves, 2 de junio de 2011

TÉCNICAS DE MEDICIÓN DE VITAMINA D: DIFICULTADES EN LA MEDICIÓN E INTERPRETACIÓN

VALERIE JEANNERET LÓPEZ
Estudiante de Medicina Interna

Universidad de los Andes


DEYANIRA GONZALEZ DEVIA

MD Internista Endocrinóloga

Hospital Universitario Fundación Santa Fé de Bogotá

Universidad de los Andes


 

Introducción

La osteoporosis actualmente constituye uno de los problemas de salud con mayor impacto a nivel mundial. Dentro de los factores de riesgo más comunes de osteoporosis primaria están la edad, la raza, el sexo femenino y la pérdida del estímulo estrogénico en mujeres postmenopáusicas. El 30% de las mujeres postmenopáusicas y entre el 50-80% de los hombres tienen una causa identificable de  osteoporosis secundaria. Dentro de las causas de osteoporosis secundaria se encuentran las enfermedades asociadas a desórdenes endocrinológicos, como el hipopituitarismo e hipogonadismo, diabetes mellitus, tirotoxicosis, hiperparatiroidismo y hemocromatosis; enfermedades crónicas y autoinmunes, como enfermedades reumatológicas, la enfermedad renal crónica, enfermedades gastrointestinales; el consumo de alcohol, cigarrillo y cafeína,  el uso de algunos medicamentos como glucocorticoides, anticonvulsivantes anticoagulantes o metrotexate; y alteraciones en el desarrollo y el metabolismo óseo, así como también nutricionales como el déficit de vitamina D.[1, 2]


La deficiencia de vitamina D es una de las causas más frecuentes de osteoporosis secundaria, por lo que es esencial detectar sus alteraciones, tanto leves como severas. Está asociada a condiciones como osteopenia, raquitismo y osteomalacia. El objetivo de este documento consiste en describir las técnicas empleadas en la actualidad para la cuantificación de la vitamina D.  Para llevar a cabo este objetivo, se presentan inicialmente las generalidades del metabolismo y funciones, así como las consecuencias de su deficiencia, para finalizar con la presentación de las técnicas de medición de la vitamina D en plasma.


El déficit de vitamina D puede definirse como niveles de 25-hidroxivitamina D menores a 20 ng/ml. Niveles de 20-32 ng/ml indican insuficiencia relativa de vitamina D, por encima de esto se consideran niveles normales.[3]  Niveles mayores a 150 ng/ml se consideran tóxicos. Se ha visto que los niveles de 25-hidroxivitamina D son inversamente proporcionales a los niveles de hormona paratiroidea hasta 30-40 ng/ml, punto en el cual los niveles de PTH  comienzan a estabilizarse. [4]


Con base  en estas definiciones, se estima que 1 billón de personas en el mundo tienen insuficiencia de vitamina D. Más del 50% de las mujeres con medicación para osteoporosis tienen niveles de vitamina D sub-óptimos. [5,6] Los niveles séricos de 25-hidroxivitamina D se relacionan directamente con la densidad mineral ósea, con un máximo de densidad alcanzado cuando sus niveles alcanzan 40 ng/ml. [7]


Fuentes Naturales de vitamina D


La vitamina D puede ser obtenida a partir de dos fuentes principales: la dieta y mediante una reacción química en la piel. La dieta es la fuente principal de vitamina D2 o ergocalciferol, a partir de hongos y plantas, mientras que la vitamina  D3, proviene de la ingestión de productos fortificados, pescado y la yema de huevo, fuentes animales. [8]  La exposición al sol y a los rayos UV induce la conversión  de 7-dehidrocolesterol a previtamina D3, que a su vez, mediante una reacción de isomerización térmica, se convierte en vitamina D3, o colecalciferol. [9, 10]


Metabolismo y excreción de la vitamina D


La vitamina D existe en el organismo en dos formas: la vitamina D3 (colecalciferol) y la vitamina D2 (ergocalciferol). Estas dos formas de la vitamina difieren en la composición de las cadenas laterales al anillo D. La primeraes sintetizada a partir de 7-dehidrocolesterol, presente en la piel, y la absorción de rayos ultravioleta. También está disponible gracias a varias fuentes naturales, como hígado, huevo, leche fortificada. La vitamina D2 se obtiene a partir de la dieta, principalmente a partir de vegetales.[11] 


La forma activa de la vitamina D es un metabolito dihidroxilado. La hidroxilación de la vitamina D ocurre en dos pasos principales; el primero ocurre a nivel de las enzimas citocromo P450 hepáticas, encargadas de agregar un grupo hidroxilo al carbono 25. Este paso depende de la disponibilidad de las  vitaminas D2 y D3. La segunda reacción de hidroxilación ocurre en el túbulo renal proximal, dando como resultado final la producción de 1,25-dihidroxivitamina D, la forma más activa de la vitamina. Esta fase del metabolismo de la vitamina D está estrechamente regulada por los niveles séricos de hormona paratiroidea (PTH), la vitamina D y fósforo (PO4). [11,12] 


La vitamina D actúa a nivel de receptores intranucleares para regular la transcripción de varias proteínas. Las principales acciones de la vitamina D se llevan a cabo en el intestino delgado, el riñón y en los huesos. En el intestino delgado, principalmente en el duodeno, la vitamina D actúa para incrementar la producción de proteínas encargadas de aumentar la absorción de calcio y PO4; a nivel renal, la vitamina D actúa sinérgicamente con la PTH para aumentar la reabsorción de calcio y PO4 en los túbulos contorneados distales, así como también inhibe por mecanismos de retroalimentación negativa la 1-hidroxilación de la vitamina D. A nivel óseo, tiene efectos directos e indirectos. Los efectos indirectos se deben al incremento en el calcio disponible para la mineralización del material osteoide. Los efectos directos consisten en la movilización de calcio, lo que genera un incremento en los niveles plasmáticos de calcio, que a su vez, promueve la mineralización de osteoide. Así, el efecto neto de la vitamina D es promover la mineralización ósea. [11,13]




FIGURA. Metabolismo de Vitamina D.  Adaptado de Ref [4.]

Después de revisar el metabolismo y las funciones principales de la vitamina D, es posible entender los efectos de su deficiencia. La carencia de vitamina D es un problema común tanto en niños como en adultos. Durante la infancia, la escasez de vitamina D puede llevar a retardo en el crecimiento y deformidades esqueléticas, y a un incremento en el riesgo de fracturas en la adultez. La deficiencia en los adultos puede exacerbar la osteopenia y osteoporosis, producir osteomalacia, debilidad muscular e incrementar el riesgo de fracturas. Es de gran interés, en los últimos años, el rol que tiene la vitamina D para la reducción de riesgo de enfermedades crónicas, cáncer, enfermedades autoinmunes, infecciosas y cardiovasculares; así como la descripción de nuevas acciones como a nivel pancreático y sistema nervioso central. [4]  


Medición de vitamina D


Como se ha revisado previamente, la deficiencia de vitamina D es bastante común; la medición de 25-hidroxivitamina D es un indicador del estado de vitamina D corporal. Es un predictor de la salud ósea, de riesgo para cáncer y otras enfermedades crónicas. Los radioinmunoensayos miden el contenido total de 25-hidroxivitamina D. La cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem reportan los valores de vitamina D2 y D3 por separado. No se usan los niveles de 1,25-dihidroxivitamina D para la detección de deficiencia de vitamina D, ya que los niveles pueden estar normales o elevados como resultado de hiperparatiroidismo secundario. [6] De igual manera, los niveles de 25-hidroxivitamina D dependen de la ingesta y la producción a partir de 7-dehidrocolesterol. [9] De esta manera, el mejor determinante para la evaluación del estado de la vitamina D son los niveles de 25-hidroxivitamina D circulantes. [14,15]


Métodos para la medición de vitamina D


Existen diversos métodos para la cuantificación de 25-hidroxivitamina D. La evaluación de la 25-hidroxivitamina D circulante inició con el advenimiento del ensayo de unión de proteínas competitivo (competitive protein-binding assay o CPBA). [16] Los primeros métodos para la medición de 25-hidroxivitamina D fueron descritos en 1970, basados en la unión competitiva a proteínas después de su extracción de un solvente. El agente de unión era la proteína de unión a la vitamina D, obtenida de suero de ratones. Más tarde, se desarrollaron métodos basados en cromatografía líquida (High Performance Liquid Chromatography (HPLC). En 1985, se desarrolló el primer radioinmunoensayo (RIA), a partir de un anticuerpo específico contra 25-hidroxivitamina D. Para evitar los problemas del uso de sustancias radioactivas, se han desarrollado marcadores basados en sustancias quimioluminiscentes y enzimas. Se han realizado avances en espectrometría de masas en tándem y en el 2004 la introducción de procedimientos basados en detección directa no inmunológica. [17]

TABLA 1. Métodos para la evaluación de la vitamina D


El ensayo de unión de proteínas competitivo ensayo evalúa los niveles circulantes de 25-hidroxivitamina D usando una proteína de unión a la vitamina D (vitamin D–binding protein  o DBP). Aunque este método es válido y útil para investigación, es complicado para utilizar como método de detección clínica de deficiencia de vitamina D. La muestra debe ser extraída en un solvente orgánico, secada con nitrógeno y purificada mediante cromatografía. Las características liposolubles de la molécula hacen que su medición sea aún más complicada mediante ensayos de unión a proteínas, además la hace vulnerable a los efectos de la matriz donde se realiza el ensayo. Los factores de la matriz cambian la habilidad de la proteína de unión para unirse a la vitamina D, disminuyendo así la validez del ensayo. [16]


El radioinmunoensayo  fue diseñado en los años 80, con el objetivo de cuantificar específicamente las fracciones D2 y D3. Se diseñó un antígeno que genera un anticuerpo, específico para 25-hidroxivitamina D2 y para 25-hidroxivitamina D3. También se diseñó un método de extracción no cromatográfico para la cuantificación de la vitamina. El grupo DiaSorin introdujo en 1985 el radioinmunoensayo. En el año 1993 se realiza la adición de un marcador de yodo y calibradores, lo que hizo posible la cuantificación de la 25-hidroxivitamina D circulante. [16]

Los métodos de medición directa para la detección de 25-hidroxivitamina D incluyen los procedimientos HPLC   y LC/MS, basados en el uso de cromatografía líquida. HPLC se refiere a un método de separación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento, que separa y cuantifica las fracciones D2 y Dy la posterior detección mediante  luz U.V. [17] Este método es altamente reproducible y es considerado actualmente como un buen patrón de oro para detección de vitamina D. Sin embargo, es dispendioso y requiere muestras muy grandes como estándar internacional. El método LC/MS es igualmente un método que emplea cromatografía líquida de alto rendimiento, asociado a detectores de masa. [17] Es viable para la medición de 25-hidroxivitamina D circulante, también cuantifica las fracciones D2 y Dpor separado. Es un método muy preciso, sin embargo su realización es costosa. Otra desventaja, es su inhabilidad para distinguir entre 25-hidroxivitamina D3 y su isómero inactivo 3-epi-25dihidroxi vitamina D3[16]


Los inmunoensayos son más fácilmente automatizados, con tiempo más corto para la obtención de resultados y los equipos están disponibles a menor costo. En contraste, los métodos cromatográficos son más complejos, arrojan resultados en un mayor tiempo y requieren personal entrenado para su manejo, así como equipos más costosos. Adicionalmente, los inmunoensayos detectan los niveles totales de 25-hidroxivitamina D y están sujetos a problemas relacionados con la matriz, mientras que los métodos cromatográficos cuantifican por separado las fracciones D2 y Dcon alta precisión. Finalmente, los inmunoensayos requieren calibradores, mientras que los métodos cromatográficos utilizan estándares primarios. Los inmunoensayos son más ampliamente usados por laboratorios clínicos por las ventajas mencionadas, mientras que los métodos cromatográficos son más utilizados en grandes laboratorios de referencia. [18]


TABLA 2. Ventajas y desventajas de los diferentes métodos para evaluación de la vitamina D

Conclusiones


La vitamina D ejerce papel imprescindible en el metabolismo óseo por lo que su medición tiene gran importancia no sólo por sus implicaciones diagnósticas sino también terapéuticas.

En Colombia cada día tenemos más disponibilidad de pruebas para la medición de vitamina D; sin embargo estas no están estandarizadas y en la mayoría de veces los resultados no podrían ser equiparables entre un método y otro. En nuestro medio  se usan varios métodos para la medición de 25 OH vitamina D,  uno basado en cromatografía (HPLC) y otros en radioinmunoensayo (DiaSorin, IDS). Sin embargo, la medición de 25-hidroxivitamina D hasta ahora se está empezando a realizar en forma rutinaria [4], debido a que su procesamiento no se puede realizar en un laboratorio básico y su costo es elevado.



Una prueba de laboratorio ideal para evaluar y monitorizar los niveles de vitamina D debe ser sensible, precisa, exacta, específica y reproducible.  Muchos métodos utilizados para evaluar la 25OHD en suero se han cuestionado  [19,20,21,22]  Parece que los problemas en la determinación de las concentraciones de 25OHD pueden relacionarse con las características lipofílicas de ésta, y con la fuerte afinidad por su proteína transportadora asociado a las características estructurales similares entre vitamina D2 y D3 [23]. Entre los problemas actuales que tenemos con la realización de pruebas de vitamina D y su interpretación se han resaltado:


1.            Subestimación de las concentraciones de vitamina D. Algunos métodos por RIA, subestiman en más de un 30% las concentraciones de 25OHD2 como es el  caso de IDS y tienen dificultades en la recuperación de los metabolitos medidos [24]

2.            Sobrestimación de las concentraciones de vitamina D. En las pruebas competitivas, la medición de otros metabolitos producto de la degradación o la isomerización de la vitamina D u otros metabolitos hidroxilados como 24,25-dihidroxivitamina D, 25,26-dihidroxivitamina D, 25,26-dihidroxivitamina D y 26, 23-lactona  sobrestiman las concentraciones entre el 10 – 20% [19,20,25]

3.            Falta de equivalencias entre los ensayos, no hay rangos de referencia para poblaciones específicas [26].

4.            La variabilidad intra- ensayo, inter-ensayo.

5.            La calidad de los materiales [20].


Las pruebas para detección para 25OHD3 o 25OHD2 utilizan diferentes metodologías variando en sensibilidad y especificidad, como se discutió en el párrafo anterior. Idealmente se necesitan otros métodos de medición que sólo midan 25OHD2 y 25OHD3 como la espectrofotometría de masas combinado con cromogratografía que elimina otros metabolitos; o el uso de pruebas muy estandarizadas para  que los estudios puedan ser comparables, estas pruebas sólo son utilizadas para evaluar las pruebas de laboratorio. 


Referencias



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